Adaptiver Autofokus verbessert Mikroskopie: Ein technischer Überblick

16.12.24

Die Mikroskopie entwickelt sich mit fortschreitender Technologie weiter, und automatisierte Fokussiersysteme sind für verschiedene Anwendungen unverzichtbar geworden. In diesem Artikel wird untersucht, wie hardwarebasierte Autofokussysteme funktionieren und wie Prior Scientific die Technologie weiterentwickelt, um neue Probentypen, einschließlich Mikrofluidik, in Forschung und Industrie zu berücksichtigen. 

Der Artikel basiert auf einem Webinar, das auf der Biophotonics Conference 2024 von Simon Bush, Produktmanager bei Prior Scientific, gehalten wurde. Das vollständige Webinar können Sie hier ansehen. 

Hardware-Autofokus verstehen: Grundprinzipien 

Hardware-Autofokussysteme unterscheiden sich grundlegend von herkömmlichen kontrastbasierten Autofokusmethoden. Während kontrastbasierte Systeme das Probenbild selbst analysieren, nutzt der Hardware-Autofokus die direkte Lichtreflexion zur Fokusbestimmung. Das System sammelt Reflexionen entweder von der Probenoberfläche oder von Ebenen innerhalb der Probe, die Brechungsindexänderungen aufweisen. Ein Regelkreis passt dann das Fokussiersystem des Mikroskops an, um den Fokus automatisch beizubehalten oder wiederherzustellen. 

Dieses Video zeigt eine Vielzahl verschiedener Proben, die unter einem Mikroskopobjektiv angeordnet wurden. Die Proben wurden so ausgewählt, dass sie eine Reihe von Materialien – Metalle und Kunststoffe – repräsentieren. Die Materialien reflektieren das vom Autofokus kommende Licht auf unterschiedliche Weise. 

Ein motorisierter Tisch von Prior wurde verwendet, um die kombinierten Proben abzutasten und zu zeigen, dass das PureFocus850 unabhängig vom Probenmaterial, dessen Struktur und den unterschiedlichen Reflexionsgraden den Fokus auf der Probe beibehält. 

So funktioniert der Hardware-Autofokus 

Hardware-Autofokussysteme enthalten entweder eine LED oder eine Laserdiode, die Licht auf die Probe emittiert, das von einem dichroitischen Spiegel (dargestellt durch die grüne Linie im Diagramm unten) reflektiert wird. Das Signal wird von einem Sensor erfasst und erkannt (in der Abbildung durch die blaue Linie dargestellt). Wenn die Probe aus dem Fokus gerät, erkennt das System ein Defokussignal und passt sich entsprechend an. Um die Fokusrichtung zu bestimmen, füllt das System nur die Hälfte der hinteren Blende des Objektivs aus, wodurch eine Richtungserkennung von Fokusänderungen ermöglicht wird.

Der Bildgebungsprozess wird durch den Hardware-Autofokus nicht beeinflusst: Prior's PureFocus850 kann an einer beliebigen Stelle im Unendlich-Raum des Mikroskops positioniert werden und ermöglicht die Übertragung aller sichtbaren Lichtwellenlängen, sodass es mit der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden kann und die Farbbalance des Bildes nicht beeinträchtigt wird. Farbkameras erkennen das schwache Licht des PureFocus mit einer Wellenlänge von 850 nm normalerweise nicht. Streulicht, das von Kameras der höheren Preisklasse erkannt werden kann, kann durch die Installation eines Kurzpassfilters leicht blockiert werden. 

Hauptanwendungen für Hardware-Autofokus 

Es gibt eine Vielzahl von Anwendungen und Einsatzmöglichkeiten für Hardware-Autofokus in der Life-Science- und Industriemikroskopie.  

1. Zeitrafferaufnahmen 

• Der Fokus wird über einen Zeitraum von 24 bis 48 Stunden auf Zellen gehalten, um nach Veränderungen in der Morphologie oder Veränderungen in der Expression verschiedener Proteine zu suchen.

• Medizinische Geräte und Mikrofluidik, bei denen die Proben dynamisch sind und eine zeitliche Auflösung erforderlich ist. 

• Mikrofluidiksysteme, Organoide oder andere biowissenschaftliche Proben mit Tiefe, bei denen der kontrastbasierte Autofokus nicht in der Lage ist, zu jedem Zeitpunkt dieselbe Bildebene zu lokalisieren. 

2. Industrielle Inspektion 

• In einer Laborumgebung oder einer Inline-Produktionsumgebung, bei der der Durchsatz entscheidend ist. 

  Der Autofokus ist aufgrund der Probengrößen und komplexen Oberflächen ideal für die Halbleiterinspektion. 

Hauptvorteile des Hardware-Autofokus PureFocus850 von Prior Scientific  

1. Geschwindigkeit und Effizienz 

• Bis zu 95 % kürzere Scanzeiten im Vergleich zu herkömmlichen Methoden 

  Schnelle Fokuserfassung ohne Mehrfachbildanforderungen reduziert das zu speichernde Datenvolumen 

2. Vielseitigkeit der Proben  

• Probenunabhängiger Betrieb 

• Effektiv bei Proben mit geringem Kontrast

3. Beständigkeit gegen Umwelteinflüsse 

• Der Fokus bleibt trotz thermischer Veränderungen um das Mikroskop herum erhalten, dies ist für die Qualität bei der Zeitrafferaufnahme wichtig 

• Minimale Auswirkungen auf Lebendzellumgebungen, da die für die Bildgebung verwendeten Lichtquellen recht schwach sein können  

Der PureFocus850 bietet auch eine Reihe spezifischer Vorteile im Zusammenhang mit seinen Funktionen: 

Signalverarbeitungsmodi

PureFocus850 ermöglicht die Verarbeitung von Proben mit Höhenunterschieden – wie z. Bsp. Halbleiterwafern. Das System verfügt über zwei Konfigurationen, die Benutzer je nach Bedarf auswählen können:

1. Punkt-Modus: Fokussiert auf einen bestimmten Punkt in der Mitte des Sichtfelds. 

• Ideal für flache Ebenen, geneigte und wellige Oberflächen. 

• Am besten geeignet für Glasobjektträger, Kulturschalen und Wellplatten. 

2. Linienmodus: Nimmt gewichtete Mittelwerte der Signale, die aus dem gesamten Sichtfeld erkannt werden. 

• Besser für Proben mit Oberflächenvariationen oder schwacher Reflexion. 

• Bietet eine gleichmäßigere Fokussierung auf unebenen Oberflächen. 

• Am besten geeignet für industrielle Proben, Halbleiterwafer oder Lab-on-a-Chip-Geräte. 

Optische Wegintegration 

Das Prior PureFocus-System wird im Unendlich-Raum des Mikroskops montiert und bietet flexible Positionierungsoptionen. Dadurch kann das PureFocus-System bei Fluoreszenzmikroskopen hinter dem Objektiv positioniert werden, um zu verhindern, dass das Autofokus-Lasersignal blockiert wird, oder bei Dunkelfeldmikroskopen vor der Tubuslinse, um eine maximale Unterdrückung von Streulicht zu gewährleisten. Bei Systemen mit Platz- oder Weglängenbeschränkungen kann es sogar außerhalb der optischen Hauptachse positioniert werden.  

Fortschrittliche Schutzfunktionen

Die Servo-Begrenzungsfunktion stellt einen entscheidenden Sicherheitsfortschritt in der Autofokus-Technologie dar. Dieses System legt feste Bewegungsbereiche in Bezug auf den Punkt fest, an dem der Autofokus erstmals aktiviert wird, und verhindert so effektiv Objektkollisionen und schützt sowohl Proben als auch Geräte. Die Funktion ist besonders bei der Arbeit mit verschiedenen Proben von Nutzen und ermöglicht eine reibungslose Bewegung zwischen benachbarten Proben bei gleichzeitiger präziser Fokussteuerung.  

Dynamische Laserleistungsanpassung 

Die Fähigkeit des Systems, die Laserleistung automatisch auf der Grundlage der Probenreflexion anzupassen, stellt einen bedeutenden Fortschritt in der Autofokus-Technologie dar. Diese dynamische Anpassung sorgt für optimale Signal-Rausch-Verhältnisse bei unterschiedlichen Probentypen und -bedingungen. Das System überwacht und passt sich kontinuierlich an Änderungen der Materialeigenschaften an und gewährleistet so eine gleichbleibende Leistung unabhängig von den Probeneigenschaften.

Schnittstellenkorrektur

Fortschrittliche Schnittstellenkorrekturmethoden sind ein entscheidender Bestandteil der Systemfähigkeiten. Die Technologie verwaltet effektiv Mehrfachreflexionen von Probenschichten und demonstriert eine ausgeklügelte Unterscheidung zwischen verschiedenen Grenzflächen. Diese präzise Steuerung ermöglicht es dem System, die richtigen Ebenen zu identifizieren und zu fokussieren, während ein falscher Fokus auf unerwünschte Oberflächen vermieden wird, wodurch eine genaue und zuverlässige Bildgebung über komplexe Probenstrukturen hinweg gewährleistet wird. Diese Funktionen sind für die Verwendung des PureFocus850 mit biologischen Proben auf Objektträgern oder in Wellplatten unerlässlich.

Systemleistung und Sicherheitsfunktionen

Signalqualitätsmanagement

Das System nutzt umfassende Techniken zur Optimierung der Signalqualität, um eine zuverlässige Leistung zu gewährleisten. Durch eine ausgeklügelte Signal-Rausch-Optimierung und die gezielte Filterung von Störquellen sorgt der Autofokus für eine gleichbleibende Genauigkeit. Mathematische Korrekturalgorithmen verbessern die Signalklarheit weiter und sorgen für eine stabile Fokussierung unter verschiedenen Bildgebungsbedingungen.

Probenerkennung  

Die Integration umfassender Sicherheitsfunktionen ist ein wesentlicher Aspekt des Systemdesigns. Fortschrittliche Crash-Prevention-Systeme arbeiten in Verbindung mit einer kontinuierlichen Signalüberwachung, um sowohl Proben als auch Geräte zu schützen. Wenn die Signalintensität einen zulässigen Schwellenwert über- oder unterschreitet, wird der Autofokus automatisch deaktiviert. 

Schlussfolgerung

Hardwarebasierte Autofokussysteme stellen einen bedeutenden Fortschritt in der Automatisierung der Mikroskopie dar. Ihre Fähigkeit, den Fokus über verschiedene Probentypen und -bedingungen hinweg schnell und präzise aufrechtzuerhalten, macht sie zu unschätzbaren Werkzeugen sowohl in der Forschung als auch in industriellen Anwendungen. Durch die kontinuierliche Weiterentwicklung von Funktionen wie der dynamischen Laserleistungsanpassung und der ausgeklügelten Signalverarbeitung werden diese Systeme immer anpassungsfähiger und für moderne Mikroskopieanwendungen unverzichtbar. 

The PureFocus850 from Prior Scientific provides real-time focus control for most infinity-corrected optical systems and is suitable for both life science and industrial samples. Learn more about the PureFocus850 or request a demonstration. 

Das PureFocus850 von Prior Scientific bietet Echtzeit-Fokussteuerung für die meisten unendlich korrigierten optischen Systeme und eignet sich sowohl für Proben aus den Biowissenschaften als auch für industrielle Proben. Erfahren Sie mehr über das PureFocus850 oder fordern Sie eine Vorführung an.