Raman- und Infrarotmikroskopie für chemisches Mapping

Automatisierung der Raman- und Infrarotmikroskopie für die Hochdurchsatzforschung

Raman- und Infrarotmikroskopie werden beide eingesetzt, um die chemische Zusammensetzung und die molekulare Struktur von Proben zu untersuchen. Sie liefern jeweils unterschiedliche Informationen über molekulare Bindungen und werden oft gemeinsam als ergänzende Techniken eingesetzt, um den Nutzern eine umfassendere Analyse von Materialien zu ermöglichen.

Die Raman-Mikroskopie beruht auf der Raman-Streuung, um Bilder zu erzeugen. Während die meisten Photonen zufällig streuen (Rayleigh- oder elastische Streuung), streuen einige wenige mit einer Energieverschiebung (unelastisch), die den Molekülschwingungen entspricht. Im Gegensatz zu den meisten Mikroskopietechniken erzeugt die Raman-Mikroskopie keine Bilder von der physikalischen Struktur der Probe, sondern liefert Informationen über die molekulare Zusammensetzung der Probe. Typische Anwendungen sind:

• Biowissenschaften: Visualisiere Zellbestandteile ohne Färbung.
• Materialwissenschaften: Stelle Spannungen in Halbleitern oder Verbundwerkstoffen dar, indem du die Molekularstruktur sichtbar machst.
• Medikamentenentwicklung: Erstelle chemische Karten in Falschfarben, um die chemische Zusammensetzung von Tabletten zu erkennen.

Infrarotmikroskopie ist ein Sammelbegriff für die Mikroskopie mit infraroten Lichtwellenlängen. Dabei kann es sich um die Infrarot-Durchlichtmikroskopie von Halbleitern, die Einzelphotonen-Fluoreszenzmikroskopie mit infrarotabsorbierenden und -emittierenden Fluorophoren oder die Mehrphotonenmikroskopie von Geweben durch die Erzeugung mehrerer Oberwellen handeln.

Das Anwendungsspektrum ist extrem breit gefächert, einige typische Beispiele sind:

• Biowissenschaften: Kartierung fluoreszenzmarkierter Proteine tief in Gewebeproben oder Organoiden.
• Materialwissenschaften: Visualisiere die Verteilung von Zusatzstoffen in Kunststoffen oder untersuche beide Seiten von Halbleiterwafern.
• Markierungsfreie Bildgebung: Die Eigenschaften des Binde- oder Muskelgewebes nutzen, um Bilder mittels Second Harmonic Generation (SHG) oder Third Harmonic Generation (THG) zu erzeugen.

Herausforderungen in der Raman-Mikroskopie

Fokusabweichung beim Mapping

Das kann bei großflächigen Scans oder ungleichmäßigen Proben vorkommen. Die Lösung ist der Einsatz eines Laser-Autofokus-Systems, das die Schärfe während des gesamten Mappings beibehält.

Prior Scientific Lösung:

PureFocus690 Laser-Autofokus System

Das PureFocus690 ist für Infrarot-Bildgebungsanwendungen optimiert und bietet eine hervorragende Lichtdurchlässigkeit über einen breiten Spektralbereich. Es unterstützt Wellenlängen bis zu 1100 nm im nahen Infrarot und alle gängigen Anregungswellenlängen für die Raman-Mikroskopie wie 532 nm, 633 nm und 785 nm, wodurch es sowohl für die IR- als auch für die Raman-Mikroskopie vielseitig einsetzbar ist.

Lange Erfassungszeiten

Bei der chemischen Kartierung wird ein Bild erstellt, bei dem jedes Pixel die chemische Zusammensetzung an diesem Punkt darstellt. Für hochauflösende chemische Karten werden Tausende von Spektren benötigt: Eine Karte mit 100 x 100 Pixeln enthält 10.000 Spektren, deren Erfassung bei einem schwachen Signal bis zu einer Sekunde oder länger dauern kann. Die manuelle Positionierung der Proben ist außerdem langsam, subjektiv und fehleranfällig.

Wenn du den Prozess automatisierst, kannst du dich auf die Überprüfung und Analyse der Daten konzentrieren.

Prior Scientific Lösung:

ProScan Motorisierter xy-Scanningtisch mit intelligenter Scantechnologie

Ein hochstabiler Tisch, der seine Position zuverlässig beibehält, ist wichtig für jede Anwendung mit langen Erfassungszeiten.

Die Prior Tische H117 High Performance Stage for inverse Microscopy und H101N1F Flat Top High-Resolution Stage for aufrechte Microscopy bieten beide eine Auflösung im Submikrometerbereich. Die Kombination aus Schrittmotoren und Kugelumlaufspindeln sorgt für ausreichend Reibung, um die Tische während der Aufnahme statisch zu halten, ohne die Bewegung zu beeinträchtigen.

Prior Tische sind mit der Intelligent Scanning Technology (IST) ausgestattet, die die Genauigkeit der Bewegungen ohne Encoder sicherstellt und Schwingungen am Ende der Bewegungen verhindert.

Queensgate’s NanoScan SP Z Series of nanopositioning Z-axis piezo stages are highly stable during long acquisition times due to their capacitive sensor technology. The piezo stages offer market-leading velocity, step-settle time, and sub-nanometer resolution.

Die Piezotische der NanoScan SP Z-Serie von Queensgate zur Nanopositionierung der Z-Achse sind dank ihrer kapazitiven Sensortechnologie auch bei langen Erfassungszeiten äußerst stabil. Die Piezotische bieten eine marktführende Geschwindigkeit, Schrittzeit und Sub-Nanometer-Auflösung.

Herausforderungen in der IR-Mikroskopie

Dickenschwankungen

Während IR sehr gut in dicke Proben eindringen kann, ist die Bildgebung in Organoiden oder Geweben mit dem richtigen Maß an Geschwindigkeit und Präzision eine Herausforderung. 

Prior Scientific Lösung:

Queensgate Z-axis piezo nanopositioning stages

Die Piezo-Nanopositionierungstische von Queensgate bieten Submikrometer-Schrittabtastung auf der Z-Achse mit langen Verfahrwegen von bis zu 800 µm, um die Bildgebung in dicken Proben zu ermöglichen. Sie sind hochstabil und erleichtern mit Schrittverstellzeiten von <10 ms die Aufnahme und Rekonstruktion von 3D-Bildern. Sie sind mit einer breiten Palette von inversen und aufrechten Mikroskopen kompatibel.

Biowissenschaftliche Proben für die IR-Bildgebung, wie z. B. Organoide in Medien oder ganze Tiere, erfordern oft, dass die Probe völlig stabil ist. Das bedeutet, dass das Objektiv und nicht die Probe zum Nachfokussieren bewegt werden sollte. Die NanoScan OP-Serie von Objektivscannern mit Nanopositionierung steuert die Bewegungen der Objektive. Sie bieten eine außergewöhnliche Wiederholbarkeit und Auflösung und haben eine Belastbarkeit von bis zu 1000 g, sodass sie die großen und schweren Objektive tragen können, die typischerweise für die Multiphotonen-Bildgebung verwendet werden. 

Die Piezotische der NanoScan SP Z-Serie zur Nanopositionierung der Z-Achse sind schlank und mit einer Vielzahl von Proben kompatibel, darunter Well-Platten, Petrischalen und Objektträger. Sie sind besonders nützlich, wenn eine hochpräzise Bewegung für mehrere Objektive erforderlich ist, die Probe aber unbeweglich ist, z. B. bei der Aufnahme von Gehirnschnitten. 

Scannen großer Proben

Die Inspektion von Halbleitern mit IR ermöglicht die Erkennung verschiedener Eigenschaften und Defekte innerhalb einzelner Chips und spart Zeit, indem beide Seiten des Wafers gleichzeitig abgebildet werden. Bei solch großen Proben ist es jedoch sehr zeitaufwändig, sie vollständig abzubilden.

Prior Scientific Lösung:

ProScan H112 Großformatbühne grossformatiges Positioniersystem mit und PureFocus690 Laser-Autofokus-System

Der motorisierte XY-Tisch ProScan H112 hat einen Verfahrbereich von 300 x 300 mm, der groß genug ist, um 12-Zoll-Siliziumwafer vollständig abzubilden. Wir bieten eine Reihe von Montagezubehör an, darunter Vakuum- oder Chuck-Halter für Wafer, Breadboards und Aluminiumplatten.

Eine weitere Herausforderung ist es, den Fokus während des Scannens auf der großen Wafer-Oberfläche zu halten. Hier arbeitet der PureFocus690 mit dem Großformattisch zusammen und hält die Probe im Fokus, indem er sich in Echtzeit an Änderungen der Probenhöhe anpasst. Dadurch kann die Scanzeit um bis zu 95 % verkürzt werden, da kein kontrastbasierter Autofokus oder volumetrische Bildgebung mehr erforderlich ist. Der PureFocus690 verfügt außerdem über eine motorisierte Offset-Linse, mit der die Fokusebene zwischen der Ober- und Unterseite des Wafers gewechselt werden kann, während der Autofokus aktiv ist.

Probendrift bei Zeitrafferexperimenten

Stabilität ist der Schlüssel zu den langen Aufnahmezeiten bei Zeitrafferexperimenten. Unabhängig davon, wie stabil die Ausrüstung aufgebaut ist, ist die Probendrift eine echte Herausforderung, vor allem bei der Bildgebung von lebenden Zellen, wo Veränderungen in der Probe die Fokusebene erheblich verändern können.

Prior Scientific Lösung:

Das PureFocus690 Laser-Autofokus-System bietet eine Echtzeit-Fokuskontrolle, die sich automatisch an Veränderungen in der Probe aufgrund von thermischer Instabilität anpasst. Durch die Verfolgung einer reflektierenden Grenzfläche in der Probe, wie z.B. der Wasser/Glas-Grenze in einer Kulturschale, kann ein Hardware-Autofokus selbst schwach kontrastierte Proben wie transgene Zebrafische über lange Zeiträume scharf stellen.

Variation des Versuchsgeräts

Multiphoton-Systeme bilden oft Objektträger/Gewebe und ganze Tiere ab, wobei spezielle Objektive verwendet werden, die für eine hochpräzise Abbildung tief in den Proben sorgen. Bei großen Proben und zusätzlichen Geräten kann der Platz eine echte Herausforderung sein.

Prior Scientific Lösung:

Unsere Physiologieplattformen bieten große Oberflächen, um große Proben und Peripheriegeräte zu befestigen, und ermöglichen gleichzeitig den Zugang für Mikromanipulatoren. 

Die hochpräzisen XYZ-Decks H189 und HZ106 bieten präzise Bewegungen in der XY- und Z-Achse. Mit einem motorisierten Z-Verfahrweg von bis zu 50 mm kann derselbe Mikroskopieaufbau, der für die Abbildung von fluoreszenzmarkierten Hirnschnitten verwendet wird, in wenigen Augenblicken für neurowissenschaftliche Experimente an ganzen Mäusen umfunktioniert werden. Für komplexere Experimente kann die Plattform, auf der die Probe befestigt ist, innerhalb des Decksystems höher oder tiefer positioniert werden, was diese Systeme extrem flexibel und ideal für die Forschung macht.

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