以经济高效的设备打造共聚焦成像系统
03.03.26
借助共聚焦显微技术，研究人员能以前所未有的精细度来观察生物样本。该技术克服了荧光显微镜的诸多局限，比如焦平面上下荧光基团造成的模糊图像，无法对厚样本清晰成像，以及高荧光样本中对比度较差等。此外，共聚焦显微技术还能对厚样本进行光学切片，使得研究人员可获得厚样本内部的清晰光学“切片”，通过叠加一系列切片可构建三维图像。同时，共聚焦成像仅照明焦平面，能有效降低光漂白风险。
不过，常规共聚焦成像系统的成本和复杂程度远超宽场荧光显微镜，导致许多无足够预算购置新设备的研究人员可望而不可及。
能否自主搭建共聚焦显微镜？
完全可以！使用Prior Scientific与CrestOptics的组件升级现有显微镜可以自主搭建高端成像系统，且成本仅为购置全新共聚焦显微镜的一小部分。
以下是我们以往构建的系统示例：
系统描述
显微镜平台：
我们采用Prior Scientific的OpenStand-V倒置模块化成像系统作为共聚焦显微镜的基础平台。得益于OpenStand的模块化设计，系统可视需要灵活配置和升级，从而满足用户定制显微镜的多变需求。同时，它也是测试和开发新型成像技术并最终实现商业化的优选原型平台。
示例系统搭载电动XY平台、激光自动对焦系统、电动物镜转轮和透射光照明；亦可进一步加装压电Z轴平台（用于微调焦控制）、额外光路、滤光片转轮或滤光转轮（用于其它成像模式）。此外，该系统兼容Nikon（尼康）、Evident（奥伟登）和Zeiss（蔡司）等品牌的光学组件，方便用户视需要选择最合适的选件，无需在性能方面做出妥协。
电动XY平台
共聚焦成像通常会生成复杂的数据集，通常需拼接形成大型样本的三维图像。因此，精准、可重复的自动定位是获得高质量结果的关键。平台不仅要运动平稳，还须具备高稳定性——这对于活细胞的时间序列成像尤为关键。平台还可选配线性编码器来进一步提升长行程线性度——时间序列成像的基本功能。
Prior Scientific的ProScan H117倒置显微镜电动XY平台采用1 mm滚珠丝杠和步进电机（400步）驱动，可实现高分辨率运动控制和优异的稳定性。该平台还集成Prior Scientific的智能扫描技术以优化平台定位精度与线性度。
与Prior Scientific的所有电动显微镜平台一样，该平台同样享受5年质保服务。
激光自动对焦：Prior Scientific的PureFocus850
激光自动对焦系统是共聚焦成像的核心，因为它能在长时间或高强度图像采集应用中维持样本精准对焦，防止因机械或温度波动导致的图像漂移。我们在系统中安装了PureFocus850来维持物镜与参考界面之间的正确距离，确保荧光成像质量稳定一致。其采用共聚焦激发波长之外的850 nm红外激光操作，无信号干扰风险。同时，其内置的二向色镜专为透射荧光发射波长而设计。
共聚焦系统：Crest Optics的CICERO
Crest Optics的CICERO是一款完整的宽场荧光与转盘式共聚焦系统，兼容大多数正置或倒置显微镜。它已成功用于Prior Scientific的OpenStand-U和OpenStand-V系统，并可提供诸多优势，比如支持宽光谱范围；可使用激光或LED照明；方便用户根据应用需求选择合适的光源和荧光染料
CICERO尺寸紧凑，与OpenStand系统高度适配，可承担整个系统的照明与检测功能，也可通过OpenStand的落射式或透射式照明光路与其它成像模式联用。
照明系统：CoolLED的pE-4000
该系统选用了CoolLED的pE-4000作为共聚焦成像的高功率LED光源，并兼顾激光安全需求。pE-4000是一款适用性极强的照明平台，能很好地补充共聚焦工作流程，尤其适合兼具激光扫描以及宽场或辅助荧光成像模式的系统。其四个独立控制通道覆盖宽泛的LED波长，为样本筛选、荧光基团验证和多模式成像提供了灵活的激发选项。此外，16个独立的LED通道与内置激发滤光片，是亮度高、固定样本成像的优选。
相机：日本滨松光子学株式会社的Orca Flash 4.0
我们选用日本滨松光子学株式会社的ORCA-Flash4.0数字CMOS相机采集共聚焦图像。该相机对弱光灵敏度极高，可检测低信号共聚焦样本；帧率最快达100帧/秒，支持活体动态成像与快速扫描。
共聚焦成像的其它可选配置
Z轴驱动：Queensgate的压电对焦装置
压电对焦装置可提供毫秒级步进和稳定时间，助力实现快速Z轴堆叠影像采集。其高速性能对于共聚焦体积成像至关重要。
Queensgate的纳米定位压电Z平台为共聚焦显微镜应用提供了优异的速度、精度和稳定性，非常适合高分辨率和高通量成像。其亚纳米级定位精度能够实现清晰的光学切片，而快速步进和稳定时间可在不降低图像质量的情况下实现快速Z轴堆叠影像采集。Queensgate平台采用闭环电容式反馈传感器，能够提供高度可重复的运动以及长期漂移稳定性，从而满足活细胞成像、超分辨率显微镜工作流程、定量三维重建等高端应用的关键需求。此外，其紧凑、低轮廓结构能轻松集成到现有显微镜平台，可在不改变光路结构与样本操作空间的前提下提升成像性能。
NanoScan SP Z系列样本定位平台可与Prior Scientific的电动XY平台（包括H117）联用，提供200 µm、400 µm、600 µm和800 µm的闭环行程。Queensgate的NanoScan OP系列压电物镜定位平台则兼容大多数显微镜物镜。
激光光源：89 North的LDI-7
在共聚焦成像中使用激光光源能获得明显优势，只是需要额外考虑激光安全问题。转盘式共聚焦成像存在光损耗，而采用高功率激光照明能有效补偿这一问题。激光本身的谱线宽度很窄，只需极少的波长纯化即可激发特定荧光标记。
我们在替代系统中使用了89 North的LDI-7系列固态激光照明器。其单激光输出功率最高达1000 mW，可提升弱样本的信号亮度，从而缩短成像时间。
LDI-7常与CICERO系统联用，比如活细胞成像等需要转盘式共聚焦高速成像的应用。对于系统集成商而言，LDI-7的联锁系统还可与Prior Scientific的ProScan III控制器耦合，打造激光安全的完整系统。
欢迎联系我们探讨您的应用需求。
上述自动化共聚焦成像系统只是我们众多示例中的代表之一，展示了如何使用Prior Scientific显微自动化组件将现有设备升级为高端成像系统，帮助实验室在预算范围内实现更大价值。欢迎联系我们以了解更多信息。
